2022年8月19日北京中醫(yī)藥大學(xué)與電子科技大學(xué)合作，在國(guó)際期刊JCR Q1區(qū)《Frontiers in Pharmacology》(IF:5.988)在線發(fā)表了題為“Revealing the Mechanism of Huazhi Rougan Granule in the Treatment of Nonalcoholic Fatty Liver Through Intestinal Flora Based on 16S rRNA, Metagenomic Sequencing and Network Pharmacology”研究成果。該研究通過宏基因組測(cè)序，16S rRNA基因測(cè)序、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接等手段，探討了HRG（化滯柔肝顆粒）通過腸道菌群治療非酒精性脂肪肝(NAFL)的作用機(jī)制。百邁客為該研究提供了16S rRNA基因測(cè)序和宏基因組測(cè)序和部分分析工作。

研究背景

非酒精性脂肪肝(NAFL)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，越來越多的證據(jù)表明腸道菌群在NAFL中起著致病作用。化脂柔肝顆粒是臨床上常用的治療NAFL的藥物。據(jù)報(bào)道，它可以降脂保肝，但還沒有研究證實(shí)該藥物的作用是否與腸道菌群有關(guān)。因此，研究者從腸道菌群的角度，研究其作用是否與腸道菌群調(diào)節(jié)有關(guān)，以進(jìn)一步探討其治療NAFL的機(jī)制。

技術(shù)路線

主要結(jié)果

1.高脂飼料引起的小鼠體內(nèi)脂質(zhì)蓄積

如圖1所示，與BC組相比，模型組大鼠肝臟脂肪堆積增多，肝臟體積增大，顏色變白，邊緣變鈍。給藥后，各組大鼠肝臟紅化程度均有不同程度的改善，尤以TH組為佳。HE和油紅O染色結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織內(nèi)可見較多的球狀變性肝細(xì)胞和較多的紅色脂肪，而給藥組較少。MC組病理程度重，TH組輕，TL組與PC組之間無顯著差異。因此，HRG可改善HFD誘導(dǎo)的肝臟脂肪堆積和體重增加，并且可能以劑量依賴的方式改善肝臟損傷。

圖1.HRG對(duì)小鼠肝臟形態(tài)、肝組織病理學(xué)的影響

2.血清分析

與空白組比較，模型組大鼠肝酶、血脂指標(biāo)升高，其中TC、HDL-C、LDL-C、AKP、ALT、AST差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而甘油三酯則無顯著差異。給藥后肝酶和血脂均低于模型組。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)在MC組和給藥組之間有顯著差異。各給藥組間TC、ALT、HDLc差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HRG組與PC組比較，AKP、AST、TG、LDL-C差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

TM組和TH組降低AKP效果優(yōu)于TL組，TG組降低AKP效果優(yōu)于TM組。PC組降低AKP的效果優(yōu)于TL組，但差于TM組和TH組。PC組降低低密度脂蛋白膽固醇的效果優(yōu)于TM組和TH組，表明高脂飼料可導(dǎo)致大鼠血脂和肝酶代謝異常，高脂高脂顆粒可改善高脂大鼠血脂代謝和肝酶活性。與陽性藥物相比，HRG在改善高密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯、堿性磷酸酶方面具有優(yōu)勢(shì)，且改善程度可能呈劑量依賴性。各組間器官指數(shù)無顯著差異，HRG對(duì)小鼠生化指標(biāo)和器官指數(shù)的影響如圖2所示。

圖2.HRG對(duì)小鼠生化指標(biāo)及器官指標(biāo)的影響

3.微生物多樣性分析

對(duì)糞便樣本進(jìn)行16s rRNA基因測(cè)序分析，在門、綱、目、科和屬的水平上對(duì)微生物群進(jìn)行了鑒定和分析，最終共鑒定到17門、26綱、56目、86科、187屬。主要物種為厚壁菌門和擬桿菌門，其次是放線菌門、疣微菌門和變形菌門。此外，物種主要分布在uncultured_bacterium_f_Muribaculacea屬和lachnospiraceae NK4A136 group，其次是uncultured_bacterium_f_Lachnospirae、Lactobacillus和Akkermansia。

在門水平（圖 3A、B），MC 組的厚壁菌門、變形菌門和放線菌門的水平高于 BC 組，而擬桿菌門和疣微菌門的水平較低。與BC組相比，給藥組厚壁菌門和變形菌門水平降低，尤其是TH組；放線菌在 TH 和 TM 組中減少，在 TM 組中最顯著，但在 PC 和 TL 組中增加。擬桿菌在 TH 和 TM 組中顯著高于 MC 組，Verrucomicrobia 在 TH 和 TM 組中增加最顯著。與BC組相比，MC組在屬水平上乳酸桿菌和脫硫弧菌的比例更高。相比之下，Akkermansia 和 Ruminococcaceae UGG-014 所占比例較低。給藥后乳桿菌（TH組下降多）和脫硫弧菌（TH組下降多）減少，Akkermansia（TH組增加多）和瘤胃球菌UGG-014（PC組增加多）增加。給藥后乳桿菌和脫硫弧菌減少，阿克曼氏菌增多，尤其是TH組； Ruminococcaceae UGG-014 增加，特別是在 PC 組。因此，初步推測(cè)HRG可增加擬桿菌門、疣微菌門、未培養(yǎng)菌f Lachnospiceae和Akkermansia，減少厚壁菌門和變形菌門、乳酸桿菌和脫硫弧菌。HRG可通過改變NAFL小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改善NAFL。

圖3 I物種組成分析

腸道菌群聚類顯示BC組和MC組樣本微生物群落差異明顯，給藥組、BC組和MC組微生物群落差異顯著。此外，Bray-Curtis PCoA 證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（圖 3J）Curtis PCoA 證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（圖 3J）。 PC1（15.21%）能較好地區(qū)分BC和MC組、MC和TM、TH組微生物群落。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明BC和MC組在微生物群落結(jié)構(gòu)上存在較大差異，并且HRG施用組和對(duì)照組在微生物群落結(jié)構(gòu)上存在較大差異。

進(jìn)一步通過LEfSe分析尋找表明組間差異biomarker。結(jié)果表明，在門水平上差異物種為擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門和疣微菌門在是顯著差異物種。在屬水平上，差異物種為雙歧桿菌、擬桿菌、Alloprevotella、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Dubosiella、Faecalibaculum和Akkermansiaceae。AFL小鼠和HRG組的優(yōu)勢(shì)菌群主要為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門。在屬水平上，差異物種主要為Adlercreutzia和Ruminococcaceae_UCG-013、Sphingomonas等。表明HRG可能通過改變厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門的菌群來改善NAFL。

對(duì)腸道菌群豐度和血清指標(biāo)參數(shù)進(jìn)行 RDA 分析，結(jié)果表明，AKP、HDL-C、TC、TG與物種分布高度相關(guān)，且呈同向分布。在屬水平上，它們與Faecalibaculum、Desulfovibrio、Dubosiella和Lactobacillus呈正相關(guān)，與Bacteroides、Akkermansia和Alloprevotella呈負(fù)相關(guān)。在門水平上，AKP、HDL-C和TG與物種分布高度相關(guān)，與厚壁菌門和放線菌門呈正相關(guān)，與Epsilonbacteraeota和Verrucomicrobia呈負(fù)相關(guān)。 Acidobacteria 和 Proteobacteria 與 AKP 和 HDLC 呈負(fù)相關(guān)，與 TG 呈正相關(guān)。擬桿菌與HDL-C呈正相關(guān)，與AKP、TG呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明，這些菌落豐度的變化與NAFL小鼠給藥前后腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)。

圖3 beta多樣性分析，LEfSe分析和RDA分析

3.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

通過對(duì)藥材中重復(fù)成分的篩選和去除，得到249個(gè)有效成分。將上述化合物用于靶標(biāo)預(yù)測(cè)、校正和重復(fù)靶標(biāo)的刪除，共獲得1186個(gè)靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。HRG的“草藥-化合物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)如圖4A所示(黃色節(jié)點(diǎn)代表藥物靶點(diǎn)，綠色節(jié)點(diǎn)代表化合物，紅色節(jié)點(diǎn)代表草藥)，在20個(gè)節(jié)點(diǎn)中，高度值的14個(gè)化合物被選為關(guān)鍵化合物(表3)。NAFL的PPI網(wǎng)絡(luò)如圖4B所示，IFD的PPI網(wǎng)絡(luò)如圖4C所示。
將與NAFL相關(guān)的靶點(diǎn)、與IFD相關(guān)的靶點(diǎn)、與化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)同時(shí)合并，得到了HRG通過腸道菌群治療NAFL的靶點(diǎn)(圖4D)。對(duì)合并后的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析和細(xì)胞Hubba分析。模塊分析顯示模塊1(圖4E，Score=7.2)和模塊2(圖4F，Score=7.0)，而cell Hubba分析顯示前10個(gè)目標(biāo)(圖4G)。最終獲得了10個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)：CXCL10、CXCL8、ICAM1、IFNG、IL10、IL1B、IL2、IL4、IL6、TNF。圖4A-F中的節(jié)點(diǎn)大小與度值呈正相關(guān)。圖4B-F中的節(jié)點(diǎn)顏色與度值呈正相關(guān)。

圖4.網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)聯(lián)分析。

(A)HRG藥材靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。(B)與NAFL有關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)。(C)與IFD有關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)。(D)HRG-IFD-NAFL合并目標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)。(E)模塊1(F)模塊2(G)Hub基因。(H)草藥-關(guān)鍵化合物-潛在靶向途徑網(wǎng)絡(luò)。(I)關(guān)鍵靶點(diǎn)可能導(dǎo)致的關(guān)鍵生物進(jìn)展圖例。

利用10個(gè)關(guān)鍵治療靶點(diǎn)、14個(gè)關(guān)鍵化合物和相關(guān)通路，通過Cytoscape構(gòu)建了“藥草-關(guān)鍵化合物-潛在靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖（圖4H）。排名前三的化合物被選為潛在化合物（槲皮素、木犀草素、山柰酚）。選擇前三個(gè)信號(hào)通路作為關(guān)鍵通路。繪制了 HRG 通過腸道菌群治療 NAFL 的通路機(jī)制（圖 4I）。將10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與3個(gè)潛在化合物進(jìn)行分子對(duì)接，共獲得18對(duì)對(duì)接結(jié)果（表4），使用 Pymol 可視化結(jié)果（圖 5）。

圖5. 分子對(duì)接模式圖

4.宏基因組測(cè)序

通過宏基因組測(cè)序研究基因功能，基于KEGG(圖6A、B)、GO(圖6C)、EGNOG(圖6D)、CARD(圖6E)和CAZY(圖6F)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了功能注釋，共注釋到了6055個(gè)KO(KEGG Ontology)和2104個(gè)EC(Ease)。結(jié)果表明，相應(yīng)的復(fù)制、推薦、修復(fù)和一般功能預(yù)測(cè)功能基因只占較高的比例。細(xì)胞壁/膜/被膜的生物發(fā)生和碳水化合物的運(yùn)輸和代謝位居第二。CARD數(shù)據(jù)庫的標(biāo)注結(jié)果表明，四環(huán)素類和多藥耐藥對(duì)應(yīng)的耐藥基因相對(duì)含量較高，其次為氟喹諾酮類和氨基糖苷類。CAZy數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果表明，糖苷水解酶(GH)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)和非催化糖結(jié)合模塊(CBM)是前三位的碳水化合物酶。

圖6G-L顯示了在每個(gè)組和樣本的不同水平上的KEGG通路的組成。與空白組和模型組相比，模型組3個(gè)層級(jí)通路的豐度均有不同程度的增加。推測(cè)HRG可能通過增加與代謝調(diào)節(jié)相關(guān)的代謝途徑來改善NAFL。

進(jìn)一步用MetagenomeSeq分析檢測(cè)第 3層級(jí) KEGG的豐度差異(p<0.05)，豐度差異圖如圖6M-X所示。結(jié)果表明，MC組蛋白酶體豐度顯著高于BC組，MC組倍半萜和三萜生物合成顯著低于BC組。與MC組相比，PC組改變了這一趨勢(shì)。與BC組相比，HRG組降解苯甲酸氟化物和降解甲苯的豐度更高。與MC組相比，HRG組豐度較高的代謝途徑包括氨基苯甲酸降解、類胡蘿卜素生物合成等。因此，HRG可能通過代謝和細(xì)胞過程改善NAFL，代謝相關(guān)途徑在其中起重要作用。氨基苯甲酸的降解、類固醇的生物合成、倍半萜和三萜的生物合成是重要的代謝途徑。

圖5.宏基因組測(cè)序結(jié)果。 （Ⅰ：功能注釋分析。Ⅱ：KEGG通路組成和豐度直方圖。Ⅲ：metagenomeSeq差異通路豐度熱圖）。

總結(jié)

綜上所述，HRG可能通過改變微生物多樣性、結(jié)構(gòu)和功能來改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFL。還有可能通過調(diào)節(jié)腸道相關(guān)的代謝途徑、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)來改善NAFL相關(guān)的脂肪堆積和肝臟損傷。這些結(jié)果有力地表明，HRG可能通過預(yù)防腸道菌群失調(diào)來減輕NAFL。此外，HRG可通過腸道菌群治療多種成分、多代謝途徑、多靶點(diǎn)的NAFL。本研究為NAFL的治療提供了新的思路，證實(shí)了腸道菌群與NAFL之間的關(guān)系，提示HRG具有良好的治療效果。

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