第一種；直接使用提供的BSCMatrixx進行運行；

第二種；如果習慣使用cellranger，可以使用提供的FQ_BMKMANU_to_10X 模塊將BMKMANU DG1000的數(shù)據(jù)轉換為10X格式直接使用cellranger分析

策略一

直接使用BSCMatrix進行分析

1、軟件依賴與安裝

1).Python: 3.8及以上，需要安裝模塊: plotly lz4 numpy Cython h5py scipy pandas pytables sklearn

2).R: 4.0及以上，需要安裝包: Seurat dplyr tibble ggplot2 plotly htmlwidgets kableExtra htmltools shiny knitr rmarkdown optparse

3).Cell Ranger: 7.0及以上

4).Seqkit (https://bioinf.shenwei.me/seqkit/download/)

依賴的軟件需要使用export添加到環(huán)境變量中，以實現(xiàn)流程的調用。

2、數(shù)據(jù)準備

1).測序數(shù)據(jù)，雙端FASTQ數(shù)據(jù)

2).參考基因組數(shù)據(jù)，基因組序列文件和gtf文件（配置文件使用的注釋文件需要包含gene和exon）

3、配置文件填寫

### Globle parameters

## data 測序數(shù)據(jù)

FQ1 /path/to/read_1.fastq

FQ2 /path/to/read_2.fastq

## Ref genome 參考基因組和gtf文件
FA /path/to/ref/file
GFF /path/to/gtf/file

## out put 輸出路徑以及輸出結果前綴

OUTDIR /path/to/result/dir/

PREFIX outfile-prefix

##other parameters 其它配置參數(shù)（期望細胞數(shù)、線程數(shù)目、內存上限100Gb，Nobam?設置為0代表不輸出bam，設置其它字符代表輸出）

EC 3000

Threads 8

RAM 100

Nobam? 1

ENV ###R和python解釋器路徑（可選，如果不提供，則放到環(huán)境變量中）

Rscript /path/to/R/bin/

PYTHON /path/to/python/bin/

4、流程運行

1).流程說明

流程分為4個步驟，功能如下：

1.1步驟1，運行fastq2BcUmiSC_v1.1，識別fastq數(shù)據(jù)中的barcode、umi

1.2步驟2，調用Cell Ranger程序，獲取基因表達矩陣

1.3步驟3，運行QC，進行umap和tsne分析

1.4步驟4，運行WebReport，得到網(wǎng)頁版報告

2).流程參數(shù)

-c config.txt 配置文件

-s 步驟選擇，0為運行1-4所有步驟，也可選擇個別步驟單獨運行，多個步驟中間使用”,”分割。

3).參考命令

./BSCMatrix -c config.txt -s 0

./BSCMatrix -c config.txt -s 1,2,3,4

./BSCMatrix -c config.txt -s 1,2

5、結果說明

01.fastq2BcUmiSC ##步驟1運行結果目錄
├── prefix.bc_stat ##不同barcode統(tǒng)計
├── prefix.filter ##barcode 過濾信息
├── prefix.qual.stat ##Reads 統(tǒng)計
├── prefix.stat ##barcode檢測統(tǒng)計
└── prefix.umi ##Reads barcode umi信息

02.cellranger/ ##步驟2 運行結果目錄
├── bmk_10x_barcode.xls ## barcode對照表
├── data/ ##數(shù)據(jù)存放目錄
├── INDEX/ ##參考基因組索引文件夾
├── Log.out ##索引構建日志文件
├── R1.fq.gz ## R1端數(shù)據(jù)
├── R2.fq.gz ## R2 端數(shù)據(jù)
├── ReadID.xls ##ReadID 信息
└── prefix/ ##調用Cell Ranger 軟件分析結果目錄

03.cluster/ ## 步驟3 運行結果目錄
├── cluster.csv ##細胞聚類結果
├── marker_gene.csv ##marker gene
├── tsne_df.xls ##tsne聚類結果
├── tsne_files/ ##tsne html附錄文件
├── tsne.html ##tsne html 格式圖片
├── tsne.pdf ##tsne pdf格式圖片
├── umap_df.xls ##umap 聚類結果
├── umap_files/ ##umap html附錄文件
├── umap.html ##umap html格式圖片
└── umap.pdf ##umap pdf格式圖片

04.WebReport/ ##步驟4 運行結果目錄
├── 10x ##調用Cell Ranger程序執(zhí)行的結果
└── bmk ##網(wǎng)頁報告

##############BSCMatrix 環(huán)境依賴######################################

1、conda 安裝

#下載
wget https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-py39_4.12.0-Linux-x86_64.sh

#下載完成之后運行（按提示安裝）
sh Miniconda3-py39_4.12.0-Linux-x86_64.sh

#安裝完成后執(zhí)行以下命令
source ~/.bashrc

2、conda 環(huán)境配置

conda create -n (環(huán)境名) python=3.9

#激活創(chuàng)建的環(huán)境
conda activate (環(huán)境名)

#添加鏡像源
conda config –add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/
conda config –add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge/
conda config –add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/pkgs/free/
conda config –add channels https://mirrors.bfsu.edu.cn/anaconda/pkgs/main/

#查看鏡像源
conda config –show-sources

3、安裝python模塊
pip3 install -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple plotly
pip3 install -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple lz4
pip3 install -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple Cython
pip3 install -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple h5py
pip3 install -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple scipy
pip3 install -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple tables
pip3 install -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple sklearn
pip3 install -i https://pypi.tuna.tsinghua.edu.cn/simple pandas

4、安裝指定R版本（v4.2）
conda install -c conda-forge r-base=4.2

5、安裝R包
conda install -c conda-forge r-seurat=4.3.0
conda install -c conda-forge r-dplyr=1.1.0
conda install -c conda-forge r-tibble=3.1.8
conda install -c conda-forge r-plotly=4.10.1
conda install -c conda-forge r-htmlwidgets=1.6.1
conda install -c conda-forge r-kableextra=1.3.4
conda install -c conda-forge r-htmltools=0.5.4
conda install -c conda-forge r-shiny=1.7.4
conda install -c conda-forge r-knitr=1.42
conda install -c conda-forge r-rmarkdown=2.20
conda install -c conda-forge r-optparse=1.7.3

6、Cell Ranger安裝
#下載
wget -O cellranger-7.1.0.tar.gz “https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-7.1.0.tar.gz?Expires=1675964753&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cHM6Ly9jZi4xMHhnZW5vbWljcy5jb20vcmVsZWFzZXMvY2VsbC1leHAvY2VsbHJhbmdlci03LjEuMC50YXIuZ3oiLCJDb25kaXRpb24iOnsiRGF0ZUxlc3NUaGFuIjp7IkFXUzpFcG9jaFRpbWUiOjE2NzU5NjQ3NTN9fX1dfQ__&Signature=IFr7ONDqEkZRR6QpU~A6719a9Mc2SD2tI1z6RrGldFFTCiY6Z7VR0x0Gr90jtvTUmYTJ2S0NyuK6SVmdeIZUCcbjz9elG1ImGx7AprTCRD3m~0se-xha2lFr87bEsbAa-7uoyW14wXRlj17b0oG9WomNvVSNNKJSzSSfCkqX3Ev9B82b~DMD-7-Hlb8lAsorv18R8y41T4UihIRdY-LE-I5Gk3fTodmBUjvSEuI3VEalsrVsrN5AdBDpwiCPqSiExODVM0RIsUDV158ceAYFiu5Y9wgbwQVOFMZGYI0d-6tO1VPo4RwwWl0X7c2q21im6BNSQrhQzoDv5cj5COesmQ__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA”

##下載完成之后解壓
tar -zxvf cellranger-7.1.0.tar.gz

##配置環(huán)境變量
echo “PATH=安裝路徑/cellranger/7.1.0/bin:$PATH” >~/.bashrc

7、安裝seqkit
conda install -c bioconda seqkit

策略二

使用FQ_BMKMANU_to_10X 對原始數(shù)據(jù)進行轉換，然后使用cellranger進行分析

#########################軟件說明#########################################
./dealFQ
Description:
Version:v1.0

Usage:
-r1 Read1 Fastq must be given #########R1端數(shù)據(jù)
-r2 Read2 Fastq must be given #########R2端數(shù)據(jù)
-o outdir optional [./] ########輸出路徑
-k keyword optional [bmk] #########關鍵字
-t threads optional [4] ##########線程數(shù)目
-h help document

Example:
dealFQ -r1 R1.fq.gz -r2 R2.fq.gz -o analysis -k bmk -t 8

#########################結果說明##########################################
├── 01.fastq2BcUmiSC
│?? ├── *.bc_stat ##不同barcode統(tǒng)計
│?? ├── *.filter ##barcode 過濾信息
│?? ├── *.qual.stat ##Reads 統(tǒng)計
│?? ├── *.stat ##barcode檢測統(tǒng)計
│?? └── *.umi ##Reads barcode umi信息
└── 02.data
├── bmk_10x_barcode.xls ## barcode對照表
├── data
│?? ├── *_S1_L001_R1_001.fastq.gz ##cellranger分析所需數(shù)據(jù) （R1.fq.gz的硬鏈接）
│?? └── *_S1_L001_R2_001.fastq.gz ##cellranger分析所需數(shù)據(jù)（R2.fq.gz的硬鏈接）
├── R1.fq.gz
├── R2.fq.gz
└── ReadID.xls ##ReadID 信息

######################################
可以使用軟件dealFQ 將DG1000數(shù)據(jù)轉換成10x cellranger兼容數(shù)據(jù)，然后用cellranger進行下游分析，文件夾內02.data/data數(shù)據(jù)即是cellranger分析所需數(shù)據(jù)。

目前常見的捕獲單細胞技術方法有：微流控和微孔板法。本文通過基于微流控法的平臺-百創(chuàng)DG1000來精準捕獲細胞，并進行后續(xù)的逆轉錄、cDNA合成與擴增、文庫構建等實驗，從而獲得每個細胞的轉錄組信息。

1、芯片加樣

處理好的細胞懸液盡量在30min以內上機實驗，長時間放置，會導致細胞活性降低。按照一定的加樣順序，分別將細胞相、膠珠相（DG1000-3′ gel beads）、油相加入到芯片（圖1:左圖）對應孔中，然后將芯片放入到百創(chuàng)DG1000微液滴生成儀中（圖1:右圖），啟動開關。

圖1：百創(chuàng)C1000芯片結構（左圖）；百創(chuàng)DG1000微液滴生成儀（右圖）

2、形成GEMs

儀器運行后，通過控制流速的方法，使得在“Y型”接口處，一個膠珠會吸附單個細胞及逆轉錄預混液一起向右流動。到了“十字”接口處，它們與油相接觸后，每一個油滴中會包裹著一個膠珠與一個細胞，也就是“油包水”（GEMs）結構。

圖2：形成“油包水”的原理（左）；“油包水”（GEMs）結構示意圖（右）。

引物結構

• 百創(chuàng)DG1000-3′ gel beads（膠珠）上固定的引物由4部分組成 ：Read1、Cell Barcode、UMI、Poly(dT)VN。
• Read 1: 是一段已知的短核昔酸序列,主要用于后續(xù)的上機測序
• Cell Barcode：片段長度54bp，種類約為88萬種，一個膠珠對應于一個特異Cell Barcode序列。
• UMI：在 mRNA反轉錄后，每一個mRNA隨機連上一個UMI，可以通過計數(shù)不同的UMI，最終確定mRNA的數(shù)量。
• Polv(dT)VN:與mRNA3’端的poly(A)結合,進行后續(xù)的逆轉錄反應

圖3：引物結構示意圖。

3、cDNA生成與擴增

GEMs形成后，細胞裂解釋放出mRNA；同時膠珠也會自動溶解，釋放出大量含有Barcode序列的引物，并利用引物末端的Ploy(dT)VN序列捕獲液滴中的mRNA，并在一個個GEM中獨立完成mRNA逆轉錄，產(chǎn)生帶有Barcode和UMI信息的cDNA。隨后“油包水”結構裂開，進行cDNA擴增。

將擴增得到的cDNA純化后，可用于后續(xù)構建測序文庫。由于每一個單細胞的cDNA文庫標記上了細胞條形碼（Barcode）。測序時，就把攜帶相同Barcode的序列視為來自同一個細胞，達到區(qū)分細胞的目的。

以上就是生成GEMs、mRNA逆轉錄、以及cDNA合成與擴增的全部內容。下期會具體介紹數(shù)據(jù)分析指標的意義。

單細胞平臺-百創(chuàng)DG1000

百創(chuàng)DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode標記等技術來實現(xiàn)高通量的單細胞精準捕獲。除了儀器以外，百創(chuàng)DG1000還有配套的2×4的獨立芯片及配套試劑盒。

百創(chuàng)DG1000部分數(shù)據(jù)展示

人PBMC

大鼠PBMC

雞PBMC

鱉PBMC

黃顙魚PBMC

牡蠣PBMC

小鼠胚胎

某魚類食道

某植物細胞核

如果您對百創(chuàng)DG1000單細胞平臺感興趣，歡迎點擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將免費為您設計文章思路方案。

10月27日，昆明動物研究所基因組研究中心和北京百邁客生物科技有限公司（以下簡稱“百邁客”）宣布達成戰(zhàn)略合作，在昆明動物所舉辦了合作簽約儀式。由青島百創(chuàng)智能制造技術有限公司（以下簡稱“百創(chuàng)智造”）自主研發(fā)的單細胞實驗平臺百創(chuàng)DG1000正式投放至昆明動物所基因組研究中心，雙方本著平臺共享、經(jīng)驗共享的原則達成后續(xù)深入合作?；蚪M研究中心主任王國棟研究員與百創(chuàng)智造副總裁劉敏及百邁客農(nóng)學事業(yè)部總經(jīng)理王淑英就單細胞未來發(fā)展方向及應用做了深入交流，并達成了重要戰(zhàn)略合作。此次合作將推動單細胞研究在動物領域的發(fā)展，讓單細胞技術能夠惠及更多的科研群體，同時也推動百邁客科研進步、技術革新。

昆明動物所生物多樣性基因組中心主任王國棟（右三），百創(chuàng)智造副總裁劉敏（正中），百邁客農(nóng)學事業(yè)部總經(jīng)理王淑英（左三）

百創(chuàng)智造副總裁劉敏對本項目進行介紹

百創(chuàng)智造副總裁劉敏表示：百創(chuàng)智造秉承“為生命科技研究提供更多可能”的理念，旨在創(chuàng)新開發(fā)儀器，芯片和試劑的同時，為實現(xiàn)生命科技核心儀器及配套試劑耗材的國產(chǎn)自主化貢獻力量。歷時3年潛心研發(fā)，于今年推出了單細胞實驗平臺百創(chuàng)DG1000和空間轉錄組芯片百創(chuàng)S1000,本次很榮幸能在昆明動物研究所投放DG1000儀器，希望在我們雙方共同合作下，助力科研工作者開啟時空轉錄組研究時代的同時,逐漸提升國產(chǎn)平臺在生物技術研究領域的核心價值。

百邁客農(nóng)學事業(yè)部總經(jīng)理王淑英表示：目前我們百創(chuàng)DG1000單細胞實驗平臺現(xiàn)已完成人、多種動植物和微生物等樣本的科研合作項目百余個，積累了豐富的項目經(jīng)驗;本項目旨在將百邁客提供自主研發(fā)單細胞實驗儀器DG1000落戶昆明動物所基因組實驗中心，借助貴單位的實驗平臺共建單細胞實驗技術聯(lián)合實驗室，進一步提升百邁客自主研發(fā)平臺在時空組學研究領域的認可度，同時也希望能給貴單位的科研工作者提供更便捷高效的服務，最終實現(xiàn)互惠互利。

實驗人員安裝及開始測試百創(chuàng)DG1000儀器

百創(chuàng)DG1000儀器介紹

單細胞極速微液滴系統(tǒng)百創(chuàng)DG1000，利用微流控、油滴包裹和Barcode標記等技術來實現(xiàn)高通量的細胞捕獲，包含微液滴生成平臺，成套的試劑芯片耗材，提供從原始下機數(shù)據(jù)到基因表達量矩陣構建的開源軟件。

圖4 百創(chuàng)DG1000產(chǎn)品組成

百創(chuàng)DG1000技術流程

百創(chuàng)DG1000利用Droplet技術來實現(xiàn)高通量的細胞捕獲。能夠一次性分離、并標記500–10000個單細胞，從而獲得每個細胞的轉錄組信息。

細胞與膠珠分別從Y型流道出來后經(jīng)過油相生成GEMs，僅在2 min內可生成15-20W皮升級微液滴。

圖5 百創(chuàng)DG1000技術流程圖

百創(chuàng)DG1000產(chǎn)品優(yōu)勢

百邁客單細胞測序技術服務介紹

百邁客作為為數(shù)不多的同時擁有單細胞測序國內外雙平臺的公司，擁有豐富的單細胞空間多組學項目經(jīng)驗。現(xiàn)已累計100+物種、制備200+種組織類型單細胞樣本。百邁客基于大量的動植物單細胞檢測技術經(jīng)驗，已經(jīng)建立成熟的單細胞懸液和植物單細胞核懸液制備體系，搭建了完善的分析流程。

百邁客開展的單細胞測序項目，不僅在醫(yī)學領域蓬勃發(fā)展，農(nóng)學領域也迎頭趕上。項目經(jīng)驗覆蓋人、鼠、畜牧類動物、水生動物、植物等，組織類型有分選的PBMC，肝、肺、胚胎、腸、耳蝸、皮膚、胃，植物的葉片、花、芽、根尖、幼果、幼莖等。無論簡單還是復雜的組織類型，百邁客都堅持創(chuàng)新、勇于挑戰(zhàn)、迎難而上！

百邁客單細胞部分項目案例

（僅展示近期項目，更多詳情請點擊下方按鈕聯(lián)系我們獲取）

2022 CBIC第四屆細胞生物產(chǎn)業(yè)大會、第二屆中國生物醫(yī)藥創(chuàng)新合作大會于2022年7月28-29日在北京隆重舉行。青島百創(chuàng)智能制造技術有限公司（百創(chuàng)智造）受邀參會。百創(chuàng)智造劉敏副總裁以“把薪助火 || 百萬級單細胞、亞細胞級分辨率空間轉錄組”進行了主題演講，分別以單細胞測序助力靶藥研究、單細胞eQTL助力疾病醫(yī)療、時空組學指導臨床用藥等視角與眾多參會代表分享、探討了時空組學在精準醫(yī)療領域的研究進展與未來展望。

圖1 劉敏副總裁發(fā)表主題演講

圖2 劉敏副總裁和參會代表分享單細胞在醫(yī)療領域的研究進展

同時，劉敏副總裁也分享了百創(chuàng)智造助力時空組學向臨床醫(yī)療邁進的亞細胞級空間轉錄組芯片-百創(chuàng)S1000和單細胞微液滴平臺-百創(chuàng)DG1000。通過與來自全國各地參會代表的溝通和交流，參會代表對我們百創(chuàng)S1000可調節(jié)的亞細胞分辨率芯片和百創(chuàng)DG1000極快的單細胞微液滴系統(tǒng)產(chǎn)生了濃厚的興趣，并希望能夠進一步探討和合作。

會議期間，到訪我們展臺的代表絡繹不絕。通過本次會議，我們也對國內細胞生物研究在精準醫(yī)學的發(fā)展有了新的理解，對單細胞多組學在臨床應用有了更加明確的方向。這些也為我們日后的相關工作提出了指導意見。

圖3 參會代表了解百創(chuàng)S1000和百創(chuàng)DG1000

百創(chuàng)智造單細胞平臺及配套試劑

為了突破單細胞試劑耗材及儀器長期以來的國外技術壟斷，降低單細胞應用的成本，讓單細胞技術能夠惠及更多的科研群體，經(jīng)過多年潛心研發(fā)，百創(chuàng)智造發(fā)布自主研發(fā)的極速單細胞微液滴系統(tǒng)-百創(chuàng)DG1000。百創(chuàng)DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode標記等技術來實現(xiàn)高通量的細胞捕獲。除了儀器以外，百創(chuàng)DG1000還有配套的2×4的獨立芯片及配套試劑盒（圖4）。

圖4百創(chuàng)DG1000

百創(chuàng)DG1000技術特點：

PBMC重復性檢測：將相同的PBMC細胞懸液分3份，通過3個不同實驗人員，用3臺百創(chuàng)DG1000儀器，獨立進行單細胞測序，得到了幾乎一致的細胞聚類分群結果，證明百創(chuàng)DG1000具有很好的可重復性及穩(wěn)定性（圖5）。

圖5 PBMC重復性測試數(shù)據(jù)

百創(chuàng)智造空間轉錄組芯片與配套試劑

為了打破空間測序市場被國外公司長期占據(jù)，以及改變主流商業(yè)化平臺的分辨率較低的的局面，經(jīng)過多年的潛心研發(fā)，百創(chuàng)智造發(fā)布了基于微孔微珠的亞細胞級分辨率的空間轉錄芯片及配套試劑-百創(chuàng)S1000。該技術直接將空間組學分辨率從100μm（主流技術平臺）提高到~5μm的亞細胞水平，標志著全面邁入國產(chǎn)化的空間轉錄組亞細胞技術時代的到來（圖6）。

圖6 百創(chuàng)S1000

百創(chuàng)S1000技術特點：

大鼠胚胎亞細胞分辨率實測數(shù)據(jù)展示：與100μm分辨率（主流技術平臺）對比，高分辨率（~50μm）下HE染色組織形態(tài)學與spots聚類空間分布圖重合度更高，精準識別空間基因表達的異質性和組織區(qū)域的特異性（圖7）。

圖7：百創(chuàng)S1000胚胎亞細胞分辨率空間轉錄組檢測結果

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