1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號(hào)：DP441）
2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號(hào)：RN40））試劑盒
3)動(dòng)物常規(guī)組織：TRIzol
4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號(hào)：217004）
5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號(hào)：2145A）試劑盒
6)EDTA抗凝血：TRIzol
2.1檢測(cè)方法
使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號(hào) ：Nanodrop2000）對(duì)于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測(cè)，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號(hào)：LabChip GX Touch HT）對(duì)完整性進(jìn)行檢測(cè)
2.2判定標(biāo)準(zhǔn)
1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫
2)濃度≥20（ng/ul）
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常
5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時(shí)若GX檢測(cè)6.0-6.4的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
3.1建庫流程
1) 利用帶OligodT的反轉(zhuǎn)錄引物通過退火與mRNA的polyA尾結(jié)合，然后加入RT逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈
2)使用含barcode的擴(kuò)增引物擴(kuò)增成雙鏈cDNA，并為樣品加上barcode
3)使用NEB Next FFPE DNA Repair Mix和NEB Next Ultra II End Repair/dA-Tailing Module完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加A
4)使用SQK-LSK114試劑盒完成測(cè)序接頭的連接
3.2建庫設(shè)備
數(shù)字 3*32PCR 儀 廠家 Appliedbiosystems 儀器規(guī)格 proflex3*32
制冷型程控五段金屬浴 廠家 天根生化 儀器規(guī)格 OSE-DB-02
3.3建庫試劑盒
1)PCR條形碼試劑盒 貨號(hào) EXP-PBC096 廠家 Nanopore
2)NEBNext FFPE DNA Repair Mix 貨號(hào) M6630L 廠家 NEB
3)NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 貨號(hào) E7546L 廠家 NEB
4)連接測(cè)序試劑盒 V14 貨號(hào) SQK-LSK114 廠家 Nanopre
4.1上機(jī)操作
1)用測(cè)序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix
2)用測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒配置上機(jī)文庫
3)用 PromethION Flow Cells 芯片，在PromethION48測(cè)序儀運(yùn)行MinKnow 軟件，開始測(cè)序，默認(rèn)運(yùn)行72 小時(shí)
4.2測(cè)序設(shè)備
PromethION48 測(cè)序儀 廠家 Nanopore 儀器規(guī)格 PromethION48
4.3測(cè)序試劑
測(cè)序芯片制備試劑盒 廠家 Nanopore 貨號(hào) EXP-FLP004
測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒 廠家 Naonopore 貨號(hào) EXP-AUX003
測(cè)序芯片 PromethION Flow Cell(R10.4.1) 廠家 Nanopore 貨號(hào) FLO-PRO114M
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