2025年1月，青島農(nóng)業(yè)大學葛偉教授與沈偉教授團隊在學術(shù)期刊《Genome Biology》上發(fā)表了一篇題為《Spatiotemporal dynamics of early oogenesis in pigs》的研究論文。該研究利用了單細胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，解析了豬早期卵子發(fā)生中的基因表達及空間組織特征。研究發(fā)現(xiàn)，豬生殖細胞在卵巢中呈“皮質(zhì)到髓質(zhì)”分布，且與人類卵子發(fā)生過程相似，表明豬是研究人類卵子發(fā)生的良好模型。RNA速度分析揭示了顆粒細胞譜系特征，空間共定位分析和細胞通訊分析顯示皮質(zhì)與髓質(zhì)區(qū)域生殖細胞與體細胞通訊模式不同，特別是NOTCH信號通路和ECM蛋白在調(diào)控中起關(guān)鍵作用，強調(diào)了卵巢微環(huán)境對生殖細胞命運的重要性。

文章標題：Spatiotemporal dynamics of early oogenesis in pigs

期刊名稱：Genome Biology

影響因子：10.1

合作單位：青島農(nóng)業(yè)大學

發(fā)表日期：2025.01.02

研究方法：單細胞轉(zhuǎn)錄組（10x Chromium）、空間轉(zhuǎn)錄組（10x Visium）、高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組（BMKMANU S1000）、免疫熒光

百邁客生物為該研究中的E65胚胎卵巢提供了BMKMANU S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務。

 

研究背景

在發(fā)育中的哺乳動物卵巢中，卵泡的位置對其生物學功能具有重要影響。休眠卵泡主要位于卵巢皮質(zhì)外部，對雌性生育周期長短具有重要影響，而生長卵泡則位于髓質(zhì)區(qū)域，對雌性生育的起始至關(guān)重要。然而，目前對胚胎階段卵巢微環(huán)境形成機制的理解尚不深入，這主要是由于該過程發(fā)生在胚胎期，涉及多種異質(zhì)細胞類型的協(xié)同作用。

在小鼠中，原始生殖細胞從外胚層遷移到生殖脊并在性腺中增殖，隨后在特定時間點沿前后軸異步啟動減數(shù)分裂。最近的研究顯示，這一過程與經(jīng)典的維甲酸信號無關(guān)，而是通過TEX14形成細胞間橋來實現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了生殖細胞微環(huán)境在決定其發(fā)育命運中的關(guān)鍵作用。

目前對卵巢發(fā)育中卵母細胞的研究主要集中在基因表達上，但對卵母細胞在卵泡發(fā)生過程中的細微空間定位及主要體細胞類型的空間動力學特征了解有限。通過空間轉(zhuǎn)錄組學和單細胞RNA測序技術(shù)，該研究揭示了豬早期卵巢發(fā)育中的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度，并發(fā)現(xiàn)人豬之間卵母細胞空間定位的保守性，進一步強調(diào)了卵巢微環(huán)境在決定卵母細胞命運中的重要作用。

 

材料方法

研究材料：通過人工授精培育妊娠豬（三元雜交：Landrace、Large White和Duroc），分別在受精后45、55、65和75天采集胚胎階段的豬卵巢樣本。

研究方法：scRNA-seq（E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，共計18,956個高質(zhì)量細胞，10x Genomics Chromium）；空間轉(zhuǎn)錄組（E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，10x Visium；E65胚胎卵巢，BMKMANU S1000）

分析方法：空間轉(zhuǎn)錄組解卷積（Cell2location）；RNA速度分析（Velocyto和scVelo）；單細胞軌跡推斷（Cellrank）；同源基因轉(zhuǎn)化（biomaRt）；細胞通訊分析（CellphoneDB、biomaRt、ktplots）；蛋白互作分析；GO富集分析；基因模塊分析（Hotspot）

驗證實驗：免疫熒光；圖像分析和定量分析；Western blotting；卵巢組織體外培養(yǎng)

 

研究結(jié)果

1.豬早期卵子發(fā)生的單細胞圖譜的構(gòu)建

為了深入揭示豬卵巢早期卵子發(fā)生的時空發(fā)育特征，研究者將單細胞RNA測序（scRNA-seq）與10× Visium空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)相結(jié)合，對豬卵巢發(fā)育過程中的細胞空間屬性進行了系統(tǒng)分析。4個發(fā)育時間點（E45、E55、E65和E75；scRNA-seq各包括2個胚胎；ST：E45、E55、E65各包括2個胚胎，E75，1個胚胎），其中包括早期卵子發(fā)生的各階段。保留了18,956個高質(zhì)量細胞，共鑒定出17個聚類，包含9種主要細胞類型：生殖細胞、雙潛能前顆粒細胞、上皮前顆粒細胞、性腺間質(zhì)細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、血管周圍細胞、T細胞、巨噬細胞。

2.豬卵巢空間轉(zhuǎn)錄組的細胞類型解卷積

為了揭示卵巢發(fā)育過程中不同細胞類型的空間動態(tài)變化，研究者進行了細胞類型的解卷積分析。盡管scRNA-seq技術(shù)為剖析復雜組織中的細胞異質(zhì)性提供了有力工具，但它缺乏細胞的空間位置信息。因此，研究者采用10× Visium空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)進行測序，以更好地展現(xiàn)豬卵巢發(fā)育過程中不同細胞類型的空間動態(tài)變化。研究者首先對ST數(shù)據(jù)進行了質(zhì)量評估，確保數(shù)據(jù)質(zhì)量符合分析要求。隨后，利用scRNA-seq數(shù)據(jù)作為參考，通過Cell2location算法對ST數(shù)據(jù)進行了細胞類型的解卷積，實現(xiàn)了細胞類型的高分辨率定位。

通過解卷積分析，研究者發(fā)現(xiàn)在E45和E55階段，細胞類型的空間分布相對較為“隨機”。然而，隨著發(fā)育進展到E65階段，研究者觀察到了一個明顯的空間分布模式：生殖細胞在E45-E55階段隨機分布在豬卵巢中，而在E65-E75階段則主要定位于皮層區(qū)域，僅有少量位于髓質(zhì)區(qū)域。對于前顆粒細胞群，我們觀察到了兩種具有不同空間定位模式的細胞類型：BPG細胞在E55之前隨機分布，并逐漸在E75時集中于髓質(zhì)區(qū)域；而EPG細胞則在整個發(fā)育過程中始終位于卵巢表面。

為進一步驗證分析結(jié)果，研究者進行了全組織染色實驗，使用生殖細胞標志物DDX4和前顆粒細胞標志物KRT19對E45至E75的胎兒卵巢進行染色，實驗結(jié)果與ST數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。此外，研究者還分析了這些陽性細胞在卵巢背腹軸上的空間分布，并通過熒光強度分析確認了生殖細胞和前顆粒細胞在皮層和髓質(zhì)區(qū)域的不同分布模式。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解豬卵巢發(fā)育過程中細胞類型的空間動態(tài)變化提供了重要線索。

3.空間尺度解析精細尺度豬生殖細胞發(fā)育軌跡

為了深入理解生殖細胞在空間環(huán)境中的發(fā)育過程，研究者提取了生殖細胞進行重新聚類。通過對生殖細胞群的精細分析，研究者發(fā)現(xiàn)了五個對應的細胞簇，分別是有絲分裂生殖細胞（FGC_mitotic）、表達MECOM和ATM的前減數(shù)生殖細胞（Oogonia_STRA8）、表達SYCP1和DMC1的減數(shù)分裂生殖細胞（Oogonia_meiotic）、表達FIGLA和NANOS1的早期卵母細胞（Pre_oocyte）以及表達ZP4和ZP3的卵母細胞（Oocyte）。

為了深入了解早期豬卵母細胞生成過程中模塊基因的功能富集情況，研究人員采用Hotspot算法，利用生殖細胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)識別了相關(guān)基因模塊，共鑒定出11個功能各異的基因模塊。通過將單個模塊投影到UMAP圖中，確定了具有簇特異性的信息性基因模塊。剖析了早期豬卵母細胞生成過程中的基因表達譜后，研究人員進一步在空間環(huán)境中研究了這一過程。通過對ST芯片上的生殖細胞進行解卷積，揭示了早期卵母細胞生成的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度。為了驗證上述分析，研究人員使用生殖細胞標記DDX4和減數(shù)分裂生殖細胞細線期標記γH2AX進行了全組織染色實驗，以定位在不同階段啟動減數(shù)程序的生殖細胞。評估了C-M軸的熒光強度后發(fā)現(xiàn)在E45和E55卵巢中，γH2AX信號沿C-M軸的水平相似，而在E65至E75卵巢中，γH2AX信號在內(nèi)皮層達到峰值，在髓質(zhì)區(qū)域則減少。

為了進一步驗證分析，研究人員還在同一E65卵巢組織上使用了更高分辨率（BMKMANU S1000；Spot點大小約為10微米）的平臺進行了ST測序。結(jié)果與E65時的Visium ST解卷積一致，使用S1000平臺在E65時可視化ZP3陽性卵母細胞的空間位置也證實了其在內(nèi)皮層的表達。

綜上所述，研究人員成功地在單細胞分辨率下再現(xiàn)了豬生殖細胞的發(fā)育過程，并闡明了豬卵巢組織中生殖細胞的空間分布模式。

4.跨物種分析揭示了豬與人類之間生殖細胞基因表達程序及空間位置模式的保守性

為了深入理解哺乳動物卵母細胞生成的空間調(diào)控機制，研究人員進行了跨物種分析。研究團隊首先獲取了妊娠后19周人類卵巢的空間轉(zhuǎn)錄組（ST）數(shù)據(jù)，并將其與豬E65時期的ST數(shù)據(jù)進行了比較，以分析卵母細胞生成各階段生殖細胞的空間位置模式。與人類情況一致的是，生殖細胞標記DDX4與5mC和5hmC的共染色顯示，在E55和E75豬卵巢中，5mC和5hmC信號在DDX4陽性細胞中不可檢測，且主要在周圍性腺體細胞中表達。這些結(jié)果進一步揭示，除了保守的基因表達程序外，人類和豬在早期卵母細胞生成過程中的表觀遺傳重編程模式也是保守的。

為了研究豬和人類早期卵母細胞生成過程中皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度是否保守，研究人員基于ST數(shù)據(jù)探索了卵母細胞生成各階段生殖細胞的空間位置模式。對于早期卵母細胞階段的生殖細胞，這些細胞在卵巢內(nèi)皮質(zhì)區(qū)域有清晰定位，而在人類中，這些細胞主要位于內(nèi)皮質(zhì)和外髓質(zhì)區(qū)域，且在內(nèi)皮質(zhì)區(qū)域豐度更高。到了卵母細胞階段，豬和人類中這些生殖細胞的位置模式相似，主要位于外髓質(zhì)區(qū)域。通過評估生殖細胞到卵巢表面的相對距離（以卵巢寬度標準化），觀察到豬和人類早期卵母細胞生成過程均顯示出生殖細胞的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度定位。這些數(shù)據(jù)不僅揭示了豬和人類早期卵母細胞生成過程中保守的基因表達程序和表觀遺傳重編程模式，還強調(diào)了兩種物種在整個早期卵母細胞生成階段空間動態(tài)的保守性。

5.基于空間轉(zhuǎn)錄組學（ST）技術(shù)解析豬卵巢發(fā)育過程中兩種顆粒細胞譜系的時空特性

在發(fā)育中的卵巢中，顆粒細胞與生殖細胞相互作用，形成了卵巢的基本功能單位，即卵泡。因此，研究人員接下來提取了顆粒細胞譜系，并使用UMAP進行了細胞聚類分析，共鑒定出10個細胞簇。分析了潛在時間基因表達動態(tài)和顆粒細胞前體發(fā)育軌跡中wave II型顆粒細胞（PreGC_II）的命運決定。與PreGC_I相比，簇6和7中的基因在PreGC_II命運決定中起關(guān)鍵作用，如WNT6、GREM1和SFRP4，這些結(jié)果共同強調(diào)了WNT信號分子在豬顆粒細胞前體命運決定中的保守作用。此外，ALDH1A2的上調(diào)表明，醛脫氫酶家族成員1A2可能在wave II顆粒細胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

使用空間轉(zhuǎn)錄組學（ST）技術(shù)對wave I型顆粒細胞前體（PreGC_I）和wave II型顆粒細胞前體（PreGC_II）的標志性基因進行了空間定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LHX9（PreGC_I的標志）和GREM1（PreGC_II的標志）的信號從E45到E75在卵巢中呈現(xiàn)特定的空間分布模式。在E65和E75，GREM1的信號明顯環(huán)繞著DDX4（生殖細胞的標志）的信號，表明卵巢卵泡組裝的早期階段，wave II型顆粒細胞（來源于皮質(zhì)區(qū)域的顆粒細胞前體）在卵巢卵泡組裝過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

接下來，研究人員分析了顆粒細胞譜系的空間特性，進行了細胞類型反卷積，并觀察到卵巢表面上皮（OSE）細胞群主要位于豬卵巢的表面，并隨著發(fā)育的進行細胞數(shù)量增加。在E45時，I型顆粒細胞前體（PreGC_I）細胞廣泛分布在髓質(zhì)中，部分位于皮質(zhì)中；在E65時，觀察到I型顆粒細胞前體（PreGC_I）和II型顆粒細胞前體（PreGC_II）分別呈現(xiàn)出特定的皮質(zhì)和髓質(zhì)分布模式。通過免疫熒光分析進一步驗證了這些發(fā)現(xiàn)，上述結(jié)果共同揭示了豬卵巢發(fā)育過程中顆粒細胞譜系的空間時間特性。

6.豬卵巢發(fā)育期間主要體細胞類型的空間特性

除了生殖細胞和顆粒細胞外，研究人員還進一步以更高分辨率分析了GI（間質(zhì)細胞）和Sm（平滑肌細胞）這兩種體細胞在豬卵巢中的空間分布模式，因為這兩種細胞類型在豬卵巢中顯示出特征性分布，表明它們可能在塑造卵巢微環(huán)境方面發(fā)揮作用，這對早期卵子發(fā)生至關(guān)重要。

將GI和Sm的標記基因整合到空間轉(zhuǎn)錄組學中，觀察到這些體細胞的空間位置隨著從E45到E75的發(fā)育進展而發(fā)生變化。通過RNA速度分析確定的分化譜系細胞和增殖狀態(tài)細胞在E45和E55時的卵巢中隨機分布，而在E65時，觀察到這些細胞在卵巢皮質(zhì)中呈現(xiàn)出明顯的空間聚集模式，特別是在生殖細胞附近。這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了豬卵巢發(fā)育早期體細胞空間位置模式的動態(tài)變化，表明它們在形成對早期卵子發(fā)生至關(guān)重要的卵巢微環(huán)境中發(fā)揮潛在作用。

7.空間共定位分析揭示了皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)存在截然不同的微環(huán)境，強調(diào)了其在調(diào)控生殖細胞命運中的關(guān)鍵作用

在闡明了發(fā)育中的豬卵巢中主要細胞類型的時空特征后，研究人員接下來研究了空間微環(huán)境的變化如何影響發(fā)育中卵巢的細胞命運決定。首先對細胞類型豐度進行了非負矩陣分解（NMF），以研究發(fā)育中卵巢中細胞的空間共定位。NMF分解的應用成功地表征了位于皮質(zhì)和髓質(zhì)的生殖細胞niche，并揭示了與不同空間來源的生殖細胞共定位的體細胞。為了全面理解細胞-細胞通信模式的功能性，研究人員使用CellphoneDB進行GO富集分析，識別了不同區(qū)域生殖細胞與體細胞之間的配體-受體（L-R）對，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域之間細胞-細胞通信模式的功能富集結(jié)果不同。

此外，研究人員觀察到皮質(zhì)區(qū)域的L-R對顯著富集了NOTCH信號通路，PreGC_ii0和PreGC_ii8表達NOTCH信號介導因子NOTCH2，而其配體DLK1和JAG1則在向減數(shù)分裂進程中的生殖細胞中表達，結(jié)果表明NOTCH2在豬早期生殖細胞命運決定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在髓質(zhì)區(qū)域細胞-細胞通信分析揭示了在卵細胞階段的生殖細胞表達了參與原始卵泡組裝的配體，包括BMP4和BDNF，而它們相應的受體，包括BMPR1A、BMPR1B和SORT1，則由PreGC i4和PreGC i7表達。研究人員發(fā)現(xiàn)髓質(zhì)區(qū)域的體細胞表達了一系列細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，而皮質(zhì)區(qū)域則不是這樣，表明ECM蛋白在調(diào)節(jié)豬卵母細胞生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

為了進一步驗證細胞通訊分析，研究人員接下來探討了在使用從E55卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)中分離的卵巢組織進行體外條件下，補充NOTCH信號抑制劑DAPT和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑多西環(huán)素是否會影響生殖細胞命運。從E55胎兒卵巢中解剖出皮質(zhì)和髓質(zhì)組織，將這些組織進行體外培養(yǎng)，并在用DAPT處理10天后觀察到皮質(zhì)卵巢組織中減數(shù)分裂標志物STRA8的表達水平顯著降低，而髓質(zhì)卵巢組織則沒有這種情況。相反，在用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑多西環(huán)素處理10天后，觀察到卵泡形成標志物LHX8的表達水平降低，而在皮質(zhì)組織中未觀察到可比的影響。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進一步支持了在空間背景下的細胞-細胞通訊分析，并強調(diào)了卵巢微環(huán)境在調(diào)節(jié)生殖細胞命運中的重要作用。

 

研究總結(jié)

綜上所述，該研究基于單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組測序，深入探討了豬早期卵子發(fā)生過程中的時空基因表達譜和卵巢微環(huán)境的空間組織，以及這些特征在人類中的保守性。這些發(fā)現(xiàn)不僅豐富了我們對豬繁殖性狀形成復雜機制的認識，還為生殖醫(yī)學領(lǐng)域的研究提供了新的視角和方法。