DNA測序技術在過去的40年中，經(jīng)歷了巨大的改進與變化。早在1977年，首次報道了Sanger和Maxam–Gilbert測序方法，Sanger測序的最大序列長度約1 kb。其對DNA總量的要求較高，一般通過克隆靶標DNA序列并連接載體，進而通過原核細胞大腸桿菌(E. coli)擴增（當時基因組De novo采用BAC文庫測序方式），其讀長短且耗時；NGS（Next-Generation Sequencing )二代測序包含很多技術平臺，其特征是對大量的DNA分子并行測序，多年來已有4個主要的NGS平臺投入商業(yè)使用：羅氏454平臺, Illumina GA/Solexa 平臺, ABI SOLiD平臺和Life Torrent平臺。在過去的10年中，Illumina因其低成本，高速和高產(chǎn)而成為測序市場的主要供應商，Illumina測序平臺具有廣適性，因此NGS已廣泛用于探索基因組學的各個領域，包括腫瘤學，微生物學，環(huán)境基因組學，宏基因組學及醫(yī)學，環(huán)境和農(nóng)業(yè)研究等，隨時其廣泛的應用，其劣勢也逐漸的突顯，即：二代測序（Illumina為代表）讀長短仍然是生物學研究的重要瓶頸，這限制了許多生物學研究的準確性，尤其是在基因組組裝研究中。在片段重復（segmental duplication），結(jié)構變異（SV，structural variations）或旁系同源區(qū)段分析中使用短讀長測序可能會導致大量假陽性。盡管測序技術和生物信息學分析在進步，但大型基因組的從頭組裝仍然具有挑戰(zhàn)性。自2015年起，以PacBio和Nanopore為代表的長讀長測序技術開始在動植物基因組De novo中初露鋒芒（圖1 A和B）。
圖1 不同測序技術讀長，準確性及基因組連續(xù)性評估
一、三代長讀長單分子測序技術的發(fā)展
?長讀長單分子測序技術（Long read single-molecule sequencing technology）又稱第三代測序技術TGS（Third-Generation Sequencing），早在2004年，由美國太平洋生物科學公司Pacific Biosciences (PacBio)?創(chuàng)立的實時（SMRT）測序是較早被廣泛使用的長讀測序技術，SMRT測序產(chǎn)生的Reads可達到約200 kb。其提供了技術上的優(yōu)勢，以鑒定遺傳變異并進一步研究其基因功能，同時作為動植物基因組組裝日臻進步完善的主要驅(qū)動力，自2015年，首篇純PacBio三代數(shù)據(jù)組裝復活草（Nature. 2015）基因組見刊Nature，開啟了三代動植物基因組De novo的紀元。與Sanger測序和NGS測序類似，PacBio測序同樣采用邊合成邊測序的方式，以其中一條DNA鏈為模板，通過DNA聚合酶合成另外一條鏈（圖2 A和B）。PacBio測序平臺相繼推出RS II，Sequel和Sequel II平臺并投入使用（Table 1）。2005年，英國牛津納米孔技術公司
圖2 三代PacBio測序原理
圖3 三代Nanopore測序原理
二、三代長讀長單分子測序技術PacBio和Nanopore的比較
PacBio和Nanopore具有共同的優(yōu)點，即長讀長；同時也具有共同的缺點即高錯誤率（糾錯前隨機分布的?5–20％堿基錯誤率），隨著新測序儀和生物信息學的不斷發(fā)展，測序平臺的優(yōu)缺點有望發(fā)生改變，無論是PacBio還是ONT測序平臺都致力于獲得更長讀長的reads的同時，兼獲高準確的堿基序列信息。
圖4 PacBio與Nanopore測序原理及信號識別原理比較
圖5 PacBio CCS測序原理及準確性評估
Nanopore超長讀長測序：盡管組裝方法不斷在改進，且已開發(fā)物理圖譜技術（光學圖譜），但讀長長短仍然是高質(zhì)量動植物基因組的限制因素。如植物基因組由于高雜合，及其復雜的多倍性和高重復含量，其組裝仍然具有挑戰(zhàn)性，讀長必須超過基因組中的主要重復序列長度，及嵌合的長末端重復序列（LTR）或單倍型Blocks，其長度可能跨越20–200 kb。雖然PacBio是提供Long Reads（>1 kb）的技術，且通常 Reads N50長度可大于20 kb，但即便是幾乎完美的15 kb reads可能無法組裝復雜植物基因組中經(jīng)常出現(xiàn)的嵌合及高度相似的重復序列。而ONT測序平臺大大解決了這一問題，與PacBio reads平均長度項目（圖6），一小部分ONT reads讀長超過300 kb，同時PacBio不包含任何大于150 kb的reads。許多復雜的植物基因組具有大于20 kb或更長的重復序列，所以即便目前ONT具有一定錯誤率，但其大大促進了基因組的組裝，從而顯著提高了基因組連續(xù)性或完整性。例如：使用ONT測序更新的擬南芥Col-0基因組最終通過組裝，減少到40個Contigs，且跨越了染色體臂（端粒到著絲粒），同時解決了前期在TAIR10參考基因組中存在的gaps及組裝錯誤(Jupe et al. 2020)。
圖6 三代Nanopore和PacBio測序讀長比較
三、百邁客雙平臺(Nanopore+PacBio）動植物基因組De novo研究策略—魚和熊掌可兼得
“魚，我所欲也，熊掌亦我所欲也；二者不可得兼，舍魚而取熊掌者也。正如在動植物基因組研究中，針對基因組組裝，為了兼顧長讀長的同時，獲得高準確性的物種基因組密碼信息，在選擇測序技術選擇(PacBio or Nanopore?)上總會有魚和熊掌不可兼得的感覺。長久以來，百邁客一直致力于成為“專業(yè)的基因組組裝專家”，擁有雙平臺的基礎上（2015年首次引進PacBio平臺；2017年首次引進Nanopore平臺），力求整合雙平臺各自的優(yōu)勢，著力于開發(fā)各種軟件、算法，為每個物種提供訂制的“基因組套餐”，即打造高質(zhì)量，高完整性的物種基因組。從本章節(jié)起，小編后續(xù)會結(jié)合新的技術策略、測試數(shù)據(jù)及文章案例，為大家?guī)砣碌幕蚪M研究策略，旨在獲得高度連續(xù)性基因組的前提下，同時完成高準確性動植物基因組密碼的破譯，即魚與熊掌可兼得。
首先通過百邁客三代Nanopore和PacBio平臺相關物種測序讀長（表1）及組裝結(jié)果的比較（表2），進一步通過我們的實際案例來看一下Nanopore測序平臺在基因組組裝中的優(yōu)勢。
通過雙平臺實測數(shù)據(jù)的比較分析: Nanopore平臺平均讀長為28.5 Kb左右，Reads N50平均讀長 38Kb左右；PacBio CLR平均讀長20 Kb左右，Reads N50平均讀長 28Kb左右；CCS平均讀長12-15 Kb，Reads N50 16~18Kb，發(fā)現(xiàn)Nanopore比PacBio平臺讀長高10 Kb左右，而PacBio CCS模式讀長遠低于CLR模式。
同時通過PacBio和Nanopore雙平臺測序數(shù)據(jù)組裝結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，利用PacBio數(shù)據(jù)進行基因組組裝Contig N50一般達到Mb級別，而利用Nanopore數(shù)據(jù)進行基因組組裝，Contig N50指標平均水平基本能再提升2倍或者更高，甚至許多物種能達到幾十Mb（如百邁客利用Nanopore測序平臺組裝的水產(chǎn)動物綠鰭馬面鲀基因組，Contig N50高達22 Mb）。
由于Nanopore測序Reads讀長長，PacBio Sequel II HiFi模式測序準確性高達99%以上，為了同時利用其雙平臺各自的優(yōu)勢，我們擬通過Nanopore測序數(shù)據(jù)對某多倍體植物進行基因組組裝，同時通過低深度PacBio CCS數(shù)據(jù)進行Polish，進而對該多倍體植物基因組連續(xù)性，完整性及準確性進行評估，以獲得高連續(xù)性，高準確的基因組密碼信息，測試結(jié)果如下：
4.?不同深度CCS 數(shù)據(jù)Polish后二代數(shù)據(jù)回比結(jié)果
5.?通過將20?x?CCS數(shù)據(jù)分別回比到10 x PacBio CCS polish及100 x Nanopore+50 x Illumina Polish后基因組，截取基因組上特性區(qū)域，進行組裝基因組單堿基準確性的比對與評估，發(fā)現(xiàn)10?x?PacBio CCS polish后的結(jié)果提升效果明顯，我們挑選了幾個實例如下：
區(qū)域1：
PacBio CCS回比結(jié)果（10x CCS Polish基因組）
PacBio CCS回比結(jié)果（100 x ONT+50 x Illumina Polish基因組）
區(qū)域2：
PacBio CCS回比結(jié)果（10x CCS Polish基因組）
PacBio CCS回比結(jié)果（100x Nanopore+50x Illumina Polish基因組）
上述分析結(jié)果中，進一步證實了前期的推測，利用Nanopore超長讀長的優(yōu)勢，組裝獲得高連續(xù)性基因組（Contig N50 約10 Mb），同時結(jié)合PacBio CCS高準確性測序，進一步提升基因組中單堿基的準確度，即魚和熊掌可兼得。高連續(xù)性基因組的獲得，對后續(xù)功能基因定位，結(jié)構變異檢測具有重要的意義；同時高準確的基因組的獲得，對于超大基因組，多倍體基因組等復雜基因組的LTR的熱點區(qū)域的研究更具突破性的意義。除此之外。在很多動植物基因組上的確存在高度復雜的區(qū)域，即使通過高深度PacBio?CCS數(shù)據(jù)依然無法矯正，這就需要通過其它相應的技術及軟件參數(shù)整合來提升基因組的準確性。
四、雙平臺(Nanopore+PacBio）基因組De novo高分文章賞析
在對同源四倍體紫花苜蓿（Medicago sativa?L.）基因研究中，首先利用了70 GB，~22x PacBio CCS數(shù)據(jù)進行基因組組裝，組裝獲得紫花苜?；蚪M大小3154 Mb，Contig N50=459 kb, 然后利用ALLHiC進行同源染色體組群的劃分，最后通過Hi-C互作熱圖、遺傳圖譜共線性、ONT數(shù)據(jù)回比、BUSCO完整性、轉(zhuǎn)錄組對基因組完整性等進行評估，值得注意的是在ONT數(shù)據(jù)回比評估中（Table 3)，文中篩選了99 GB ONT long reads中的最長200條reads（ranged from 95 to 263 Kb）進行回比，發(fā)現(xiàn)89%的的reads都能比對到single染色體上，結(jié)合其它評估方法，進一步說明了組裝及染色體位置的準確性。
在小墊柳（Cushion willow）基因組組裝中，首先利用SMARTdenovo對糾錯后的74xONT數(shù)據(jù)進行組裝，然后分別利用125xPacBio數(shù)據(jù)(two rounds )與Illumina數(shù)據(jù)(five rounds )進行polish，基因組完整性評估后，利用Hi-C將Contig掛載到染色體水平，最終組裝獲得小墊柳基因組大小339.588 Mb，Contig N50=9.522 Mb。?(Table 4)
五、百邁客Nanopore、PacBio平臺動植物基因組合作文章總覽(部分）
北京百邁客生物科技有限公司自2015年引入Pacbio測序平臺，2017年初引入Nanopore測序平臺以來，截止到目前百邁客已擁PacBio平臺：RS Ⅱ、PacBio Sequel、PacBio sequel Ⅱ；Nanopore 平臺：PromethION-48、PromethION-β、Nanopore GridION、MinION，擁有主流三代測序儀，尤其針對復雜超大基因組測序，百邁客生物具有三代測序通量，以滿足超大基因組的組裝需求。同時PacBio和Nanopore兩大主流三代測序平臺各自及組合經(jīng)驗，為老師們提供了可參考且全面優(yōu)質(zhì)的選擇！選擇我們，提供專屬于您基因組套餐！
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