雜志：BMC Genomics

影響因子：3.594

研究背景

龍眼(Dimcarpus Longan?Lour.)為無患子科熱帶/亞熱帶常綠果樹，原產(chǎn)于中國(guó)南部和東南亞，現(xiàn)已在東南亞、南亞、澳大利亞和夏威夷等地廣泛種植。龍眼胚發(fā)育狀況與種子大小、座果率、果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。由于其高度的遺傳雜合性和在體內(nèi)獲取早期胚胎的困難，在分子水平上闡明胚胎發(fā)育機(jī)制仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生（SE）幾乎在所有發(fā)育階段都與正常合子胚胎發(fā)生有密切的相似性，SE已被廣泛用于研究植物早期胚胎發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制研究中。在過去的幾年里，利用RNA-seq測(cè)序技術(shù)挖掘了棉花、擬南芥、玉米、挪威云杉、椰子、巴西松、樟樹、草莓、水稻、小百合、山竹、番木瓜和小麥等不同物種SE相關(guān)基因及調(diào)控模式，最近，龍眼基因組草圖序列問世，為研究SE的分子調(diào)控提供了全面的基因組信息。從非胚性愈傷組織(NEC)到胚性愈傷組織(EC)，從EC到體細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)變是SE的關(guān)鍵步驟。然而，龍眼SE過程中的分子調(diào)控機(jī)制在很大程度上還不清楚。

材料方法

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料：龍眼NEC、EC、不完全致密原胚性組織(ICpEC)和球形胚(GE)組織，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；

測(cè)序平臺(tái)：Illumina HiSeq? 2000

QRT-PCR驗(yàn)證：龍眼NEC、EC、ICpEC、GE、魚雷狀胚(TE)和子葉胚(CE)

研究結(jié)果

1. RNA-Seq 與基因組比對(duì)分析

為了在轉(zhuǎn)錄水平上全面了解龍眼SE，作者對(duì)四個(gè)體外胚胎發(fā)育階段(NEC、EC、ICpEC和GE)進(jìn)行了測(cè)序。去除低質(zhì)量序列后，共獲得了243,783,126 clean reads，在與龍眼參考基因組比對(duì)后，4個(gè)cDNA文庫分別有48,798,229(81.62%)，52,623,741(81.1%)，48,346,067(81.14%)和48,871,200(82.08%)測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到龍眼參考基因組。其中44,655,772個(gè)(74.69%)，48,333,703個(gè)(74.50%)，44,490,292個(gè)(74.67%)，44,924,511個(gè)(74.45%)唯一比對(duì)。同時(shí)，4個(gè)cDNA文庫中分別有34,380,246(57.51%)，35,386,494(54.54%)，30,535,088(51.25%)和29,214,788(49.07%)個(gè)比對(duì)到基因。4個(gè)文庫分別產(chǎn)生了22743、19745、21144和21102個(gè)轉(zhuǎn)錄本，過濾掉小于180bp的短序列和低于2的低測(cè)序深度序列后，在4個(gè)樣本中分別檢測(cè)到1935、1710、1816和1732個(gè)新基因。其中1025、819、832和806個(gè)為編碼RNA。4個(gè)階段共檢查到130,354個(gè)AS事件，包括外顯子跳躍、內(nèi)含子保留、5’可變剪接和3’可變剪接。檢出AS事件多的是GE(39,768)，其次是ICpEC(36,446)和NEC(35,084)，EC少(19,056)。外顯子跳躍是所有樣本中少的剪切類型，內(nèi)含子保留是NEC、ICpEC和GE中常見的AS事件類型。

圖1 可變剪切類型分析

2. 基因表達(dá)分析

NEC、EC、ICpEC和GE期分別有22743，19745，21144和21102個(gè)基因表達(dá)。其中，75.3%以上的基因在4個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，2645個(gè)基因僅在NEC中表達(dá)。然而，在EC、ICpEC和GE階段中特有表達(dá)基因只有366、505和588個(gè)，這表明在這四個(gè)發(fā)育過程中存在著不同的空間轉(zhuǎn)錄模式。通過RSEM軟件將基因表達(dá)歸一化為FPKM，以FPKM>60篩選高表達(dá)基因，NEC、EC、ICpEC和GE中高表達(dá)基因分別為2961個(gè)(11.40%)、3445個(gè)(13.26%)、3445個(gè)(13.26%)和3442個(gè)(13.25%)。與SE相關(guān)的基因LEC1、L1L、PDF1、LTP、HSP90等在EC、ICpEC和GE中高表達(dá)。

為了揭示與早期SE相關(guān)的基因表達(dá)信息，作者以|log₂Fold Change|≥1和FDR<0.001為閾值，篩選差異表達(dá)基因(DEG)，四組比較如下：NEC_VS_EC、EC_VS_ICpEC、EC_VS_GE和ICpEC_VS_GE，分別篩選出10642，4180，5846和1785個(gè)差異表達(dá)基因。與NEC相比，EC有4887個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，5755個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。與EC相比，ICpEC有2689個(gè)上調(diào)基因和1491個(gè)下調(diào)基因，GE有3451個(gè)上調(diào)基因和2395個(gè)下調(diào)基因。與ICpEC相比，GE有832個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，953個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。DEGs分析表明，龍眼轉(zhuǎn)錄組在SE過程中發(fā)生了顯著的動(dòng)態(tài)變化，特別是在NEC向EC的過渡期。因此，本文提供的龍眼SE轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可能為今后的研究提供了有價(jià)值的分子資源。

圖2 差異表達(dá)基因分析

3. 差異基因的GO與KEGG分析

為了評(píng)估DEGs的潛在功能，作者使用GO數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行注釋，在所有分組中，在biological process中所占比例大的是“代謝過程”，“細(xì)胞過程”、“單個(gè)生物過程”、“對(duì)刺激的反應(yīng)”和“定位”，在cellular component中所占比例是“細(xì)胞”和“細(xì)胞部分”，“細(xì)胞器”和“膜”，在“molecular function”中所占比例大的是“催化活性”、“轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性”、“分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性”和“核酸”。作者利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)DEGs的功能進(jìn)行了分類，重點(diǎn)是生物學(xué)途徑。根據(jù)KEGG注釋，將6516個(gè)DEGs (NEC_VS_EC)注釋到128個(gè)通路，將2514個(gè)DEGs (EC_VS_ICpEC)注釋到126個(gè)通路，將3555個(gè)DEGs (EC_VS_GE)注釋到126個(gè)通路，將1062個(gè)DEGs (ICpEC_VS_GE)注釋到111個(gè)通路。這些通路主要集中在“代謝途徑”、“次生代謝物的生物合成”、“植物-病原菌相互作用”和“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”。此外，還有數(shù)十個(gè)基因參與了“類黃酮生物合成”、“苯丙烷生物合成”、“玉米素生物合成”、“脂肪酸生物合成”和“不飽和脂肪酸生物合成”。

4. 植物激素信號(hào)通路及類黃酮和脂肪酸生物合成相關(guān)基因分析

根據(jù)KEGG注釋信息，植物激素相關(guān)基因顯著差異，EC與NEC和早期SE相比，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因顯著差異表達(dá)。在生長(zhǎng)素生物合成中，除PAI外，色氨酸合成關(guān)鍵基因ASA、IGS、TSA、TSB在EC中表達(dá)上調(diào)，并在SE早期保持高表達(dá)。此外，參與脫落酸、赤霉素、乙烯、水楊酸、茉莉酸和油菜素甾體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的眾多基因在龍眼SE中也有差異表達(dá)。這樣的觀察表明，激素及其復(fù)雜的通路在SE早期起著重要作用。因此，植物激素信號(hào)通路可能是龍眼早期SE的關(guān)鍵調(diào)控因子。

類黃酮生物合成和脂肪酸生物合成是KEGG的代表途徑，在早期的SE過程中，共有125個(gè)顯著的DEG被注釋為“類黃酮生物合成”相關(guān)基因。在由NEC向EC過渡的過程中，類黃酮生物合成關(guān)鍵基因主要在NEC中表達(dá)，此外，大多數(shù)FLS和F3’H家族主要在NEC中表達(dá)，在EC中表達(dá)顯著下調(diào)。11個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄差異表達(dá)。在龍眼SE期間，MYB12和MYB111在NEC中幾乎沒有表達(dá)，從NEC到EC表達(dá)顯著上調(diào)，在SE早期保持較高水平。MYB75、MYB113、MYB4和MYB123在EC中表達(dá)顯著下調(diào)，在SE早期維持相對(duì)較低表達(dá)。共有35個(gè)脂肪酸生物合成相關(guān)基因在SE過程中差異表達(dá)。

圖3 類黃酮生物合成途徑分析

5.胞外蛋白編碼基因及SE分子標(biāo)志物篩選

? ? ? 已有研究表明，GLPs、AGPs、CHIs、LTPS和糖蛋白對(duì)SE起關(guān)鍵作用，可作為SE早期的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。在本研究中，共有有16個(gè)CHI在NEC中有差異表達(dá)，其中大部分在NEC中較高表達(dá)，在EC中顯著下調(diào)。大部分LTP主要在NEC中表達(dá)，從NEC到EC表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，12個(gè)GLP和2個(gè)分泌型糖蛋白(EP1-like)主要在NEC表達(dá)，并且在SE早期維持很低的FPKM。結(jié)果表明，大部分胞外蛋白編碼基因主要在NEC中表達(dá)，推測(cè)它們可能參與了NEC向EC的轉(zhuǎn)變。

為了研究龍眼早期SE分子標(biāo)記的全面性，本研究通過對(duì)龍眼根、莖、葉、花、花蕾、幼果、果皮、果肉和種子等9個(gè)組織中的FPKM進(jìn)行比較分析，篩選出SE早期的分子標(biāo)記基因。作者發(fā)現(xiàn)共有55個(gè)基因被鑒定為與SE密切相關(guān)的代表性分子標(biāo)記，依據(jù)它們?cè)谒袦y(cè)試樣本中的特異性表達(dá)譜，可以分為兩大類：NEC標(biāo)記和SE分子標(biāo)記。SE標(biāo)記基因在NEC中幾乎檢測(cè)不到，在SE早期高表達(dá)，也可分為SE特異性基因和SE高表達(dá)基因。SE特異性基因僅在體細(xì)胞胚中高轉(zhuǎn)錄，包括LEC1、LEC2、WOX9、WOX2等。這些SE特異性基因可能在龍眼SE中起關(guān)鍵作用。SE高表達(dá)的基因與SE特異性基因相似，不同之處在于這些基因在本研究的一個(gè)或幾個(gè)被測(cè)組織中也高表達(dá)，包括ABI3、FUS3、PDF1.3等。相反，28個(gè)有代表性的NEC標(biāo)記基因在NEC中高表達(dá)和特異表達(dá)，包括LEA5、CNOT3等。

6.QRT-PCR驗(yàn)證

作者對(duì)16個(gè)分子標(biāo)記在包括NEC、EC、ICpEC、GE、TE、CE在內(nèi)的組織中進(jìn)行QRT-PCR驗(yàn)證，根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，所有選定的基因在不同發(fā)育階段都有不同水平的表達(dá)。DlLEC1、DlPDF1.3、DlGH3.6、DlPIN1、DlWOX9、DlWOX2、DlGIF2、DlRGF3、DlPLT2和DlAGL80在NEC中幾乎未檢測(cè)到，在EC中表達(dá)高，然后在SE中表達(dá)下調(diào)，在TE和CE中表達(dá)相對(duì)較低，表明這些分子標(biāo)記在EC的誘導(dǎo)和維持中起重要作用。DlL1L、DlBBM、DlABI3和DlLTP在SE過程中高表達(dá)或上調(diào)，在NEC中低表達(dá)或未發(fā)現(xiàn)表達(dá)，表明這些標(biāo)記基因可能正向調(diào)控龍眼SE的發(fā)育。此外，DlLEA5和DlCHI的轉(zhuǎn)錄水平在NCE中高度特異表達(dá)，可能是NEC向EC轉(zhuǎn)化的抑制因子。SE相關(guān)基因的qRT-PCR驗(yàn)證也顯示RNA-seq和QRT-PCR數(shù)據(jù)之間高度相似。

圖4 QRT-PCR驗(yàn)證

總結(jié)

作者研究建立了龍眼SE的高分辨率轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集。對(duì)早期SE階段表達(dá)模式的比較分析提供了調(diào)控龍眼SE的DEG亞群。揭示了植物激素相關(guān)基因如生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑、類黃酮和脂肪酸生物合成途徑、胞外蛋白以及具有代表性的分子標(biāo)記基因在龍眼SE中的表達(dá)譜，表明它們可能在龍眼SE中發(fā)揮作用。這些轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)為未來的功能研究提供了新的見解。

 

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