甲狀腺激素受體-β (THR-β) 激動劑 MGL-3196 作為代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎 (MASH) 藥物，然而其個體臨床療效差異較大，并與宿主肝腸循環(huán)中的微生物組存在相互作用，目前其對宿主肝腸循環(huán)中腸道菌群的干擾尚不明確。

2024年8月21日，北京大學(xué)崔一民、安徽醫(yī)科大學(xué)王華教授共同通訊在Journal of Hepatology期刊在線發(fā)表題為“Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids”的研究論文。研究團(tuán)隊運(yùn)用宏基因組、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和代謝組組學(xué)研究了甲狀腺激素受體-β激動劑HSK31679在改善代謝相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）方面的作用，并探究了腸道菌群在其中扮演的角色。研究發(fā)現(xiàn)，HSK31679能夠有效改善SPF小鼠的MASH，但無菌小鼠則沒有這種效果，說明腸道菌群在HSK31679的治療中起到了關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)，HSK31679能夠增加腸道擬桿菌thetaiotaomicron的相對豐度，并抑制其萄糖神經(jīng)酰胺合成酶（GCS）活性，從而減少腸道微生物鞘脂的單糖基化，進(jìn)而改善肝臟脂肪積累。此外，HSK31679還能夠重塑髓系細(xì)胞動態(tài)，使其向抗炎微環(huán)境轉(zhuǎn)變，從而進(jìn)一步減輕MASH。

文章標(biāo)題：Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids

發(fā)表期刊：Journal of Hepatology

影響因子：26.8

合作單位：北京大學(xué)

研究對象：小鼠模型、臨床隊列

研究方法：微生物多樣性測序，宏基因組測序，代謝組檢測

百邁客生物為該研究提供了微生物多樣性測序，宏基因組測序，代謝組檢測服務(wù)。

研究背景

甲狀腺激素受體-β (THR-β) 激動劑，如 MGL-3196 和 HSK31679，因其對 THR-β 的選擇性高而被認(rèn)為是治療 MASH 的新興藥物。MGL-3196在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的療效，但其個體臨床療效差異較大，且存在腸道通透性差的問題。HSK31679 是 MGL-3196 的衍生物，其療效和安全性正在進(jìn)一步研究中。腸道微生物組與宿主的代謝健康密切相關(guān)，其組成和功能的改變與 MASH 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腸道微生物可以產(chǎn)生多種酶，參與宿主血漿脂質(zhì)代謝，并可能影響 THR-β 激動劑的活性。該研究旨在探索腸道微生物在 THR-β 激動劑治療 MASH 中的作用，評估 HSK31679 的療效和機(jī)制以及為 MASH 的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

材料方法

1.動物實(shí)驗(yàn)

對無菌小鼠和 SPF 小鼠進(jìn)行高脂飲食誘導(dǎo)的 MASH 模型構(gòu)建，分別給予 MGL-3196 和 HSK31679 治療，觀察肝脂肪變性程度和肝臟指標(biāo)變化。

對 SPF 小鼠進(jìn)行?B. thetaiotaomicron 菌株定殖，觀察 HSK31679 對 MASH 模型的影響。

2.微生物組分析：

對參與者的糞便進(jìn)行宏基因組測序，分析腸道菌群組成變化。

對參與者的糞便和血清進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，檢測腸道微生物產(chǎn)生的鞘脂類物質(zhì)變化。

3.單細(xì)胞 RNA 測序：

對18例PBMC樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，分析 HSK31679 對免疫細(xì)胞的影響。

研究結(jié)果

1.HSK31679 在 SPF 小鼠中優(yōu)于 MGL-3196 治療高脂飲食誘導(dǎo)的 MASH

為了研究THR-β激動劑治療 MASH對腸道微生物群的影響，研究者在沒有腸道微生物定群的情況下飼養(yǎng)的C57 BL/6 GF小鼠喂食高脂肪、果糖和膽固醇飲食（MASH飲食）和SPF對照組16周。然后每日給予MGL-3196或HSK 31679 3毫克/kg劑量，口服，持續(xù)8周（圖1A）。如圖1B所示，MGL-3196灌胃對SPF和GF小鼠的體重均沒有明顯影響，而HSK 31679導(dǎo)致SPF小鼠的體重增加具有統(tǒng)計學(xué)意義，但GF小鼠沒有。服用MASH飲食然后接受MGL- 243 3196/HSK 31679處理的SPF小鼠表現(xiàn)出肝臟重量明顯下降（p < 0.01;圖1C），HSK31679 組 SPF 小鼠的體重增加、肝臟重量、血清和肝臟甘油三酯和膽固醇水平、血清 ALT、AST 和 GGT 水平以及肝臟脂質(zhì)變性程度均顯著低于 MGL-3196 組。HSK31679 組 SPF 小鼠的肝臟炎癥和纖維化相關(guān)基因表達(dá)水平也顯著低于 MGL-3196 組。無菌小鼠模型中，MGL-3196 和 HSK31679 組的 MASH 病理表現(xiàn)相似，表明 HSK31679 的療效依賴于腸道菌群。

2.HSK31679 治療增加了腸道 B. thetaiotaomicron?的相對豐度

在MASH飲食喂養(yǎng)16周和HSK31679治療8周后，觀察到SPF小鼠富含腸道擬桿菌thetaiotaomicron（B. thetaiotaomicron）（圖1I、J和S2D）。NMDS和PCA分析表明HSK31679重塑了β多樣性譜，而每組腸道微生物群的Shannon和Simpson多樣性指數(shù)略有差異（圖S2G和H）。在微生物功能方面，通過KEGG分析富集的7,458條功能途徑。其中22條途徑在HSK31679治療后有所不同，包括參與激活神經(jīng)鞘脂（SL）代謝的途徑，在HSK31679實(shí)驗(yàn)組中，B. thetaiotaomicron與上調(diào)的己糖神經(jīng)酰胺加工基因密切相關(guān)（圖1L）。

為了臨床驗(yàn)證微生物組組成的這種轉(zhuǎn)變，研究者收集了40名健康參與者的糞便樣本，這些參與者接受了每周3次的HSK31679多次遞增劑量治療，持續(xù)14天。對參與者的糞便進(jìn)行宏基因組測序分析，鑒定了代表183個科和119個屬的415種微生物物種。香農(nóng)和辛普森多樣性指數(shù)在兩組中幾乎沒有受到HSK31679治療的影響（圖S3A和B）。相比之下，PCA評分和NMDS均顯示了HSK31679處理14 d后腸道微生物群β多樣性譜的顯著變化。對51個不同的細(xì)菌屬進(jìn)行屬級微生物Spearman相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)HSK31679處理后有幾個屬與擬桿菌屬呈正相關(guān)（圖S3D）。

隨后通過LEfSe分析探索了HSK31679治療組14天與安慰劑組相比的腸道菌群差異，這進(jìn)一步揭示了桿菌屬的最大增量（圖2B，C）。值得注意的是，在第14天上升劑量為80mg、120mg、160mg HSK31679后，B. thetaiotaomicron的相對豐度表現(xiàn)出最明顯的逐漸上升（圖2C），并通過qPCR進(jìn)行了驗(yàn)證（圖2D），這表明B.thetaiotaomicron可能在HSK31679治療期間發(fā)揮關(guān)鍵中介作用。KEGG通路分析富集了20個信號通路的154個功能基因，其中神經(jīng)酰胺代謝被HSK31679處理激活（圖2E）。這些顯著的成分變化與以前對晚期脂肪性肝炎患者微生物種群負(fù)相關(guān)的研究一致。

3.HSK31679 治療抑制了?B. thetaiotaomicron?產(chǎn)生的鞘脂類物質(zhì)的單糖基化過程

基于 B. thetaiotaomicron?的 SLs 可以轉(zhuǎn)移以調(diào)節(jié)肝臟脂肪變性這一認(rèn)識，隨后研究者試圖確定 HSK31679 314 治療是否已深入調(diào)節(jié) SLs 表型。對接受多次遞增劑量 HSK31679 316 和安慰劑治療的參與者的糞便代謝物進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)?HSK31679 治療顯著降低了腸道 B. thetaiotaomicron?產(chǎn)生的鞘脂類物質(zhì)（如 Hex1Cer 和 Hex2Cer）的單糖基化程度。

HSK31679 治療組的腸道菌群與鞘脂類物質(zhì)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，HSK31679 治療的綜合統(tǒng)計相關(guān)性分析證實(shí)，擬桿菌和普雷沃氏菌與 C16:0 和 C24:1 ?；湹募禾巧窠?jīng)酰胺呈負(fù)相關(guān)（圖 3D）。這表明口服 HSK31679 治療可抑制微生物對神經(jīng)酰胺的單糖基化。

4.thetaiotaomicron 的 GCS 活性對 HSK31679 減輕 MASH 的作用至關(guān)重要

進(jìn)一步研究了HSK 31679介導(dǎo)的SLs 單糖基化的潛在機(jī)制。通過體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)無菌小鼠模型，發(fā)現(xiàn) HSK31679 治療抑制了 B. thetaiotaomicron?的 GCS 活性。在無菌小鼠模型中，B. thetaiotaomicron?GCS 活性缺失的小鼠對 MGL-3196 和 HSK31679 的療效沒有顯著差異，而 GCS 活性存在的小鼠對 HSK31679 的療效顯著優(yōu)于 MGL-3196。HSK31679 與 B. thetaiotaomicron GCS?的結(jié)合結(jié)構(gòu)分析表明，HSK31679 通過空間位阻效應(yīng)抑制了 GCS 的活性。

5.HSK31679治療的單細(xì)胞圖譜

為了深入了解腸道微生物GCS在所有免疫細(xì)胞群中治療HSK31679的獨(dú)特免疫作用，研究者使用基于液滴的單細(xì)胞平臺（10×Genomics Chromium）進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq），分析了來自參與者隊列的18個外周血單核細(xì)胞（PBMC）樣本，包括3個用安慰劑（GH-PL）治療的糞便來源GCS高活性樣本、3個用160 mg HSK31679（GH-HS）治療的糞便來源GCS高活性樣本，和GCS低活性樣本（GL-HS）分別在第0天和第14天。從GH-PL、GH-HS、GL-HS數(shù)據(jù)集中獲得的128031個細(xì)胞中，共鑒定出57個細(xì)胞簇。通過SingleR v.1.0獲得的基于標(biāo)記的注釋，定義了四種主要的細(xì)胞類型：T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）和B細(xì)胞、髓系細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（EC）和間充質(zhì)細(xì)胞（圖5B）。通過計算觀察到的細(xì)胞數(shù)與預(yù)期細(xì)胞數(shù)的比值（Ro/e）來量化主要細(xì)胞團(tuán)相對不同的富集情況，發(fā)現(xiàn)髓系細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成了GH-HS的主要改變的細(xì)胞成分，B細(xì)胞、EC團(tuán)主導(dǎo)了GL-HS樣本的細(xì)胞成分（圖5C、D和圖S8C）。鑒于如上所述，HSK31679治療通過B.thetaiotaomicron的GCS減輕了脂肪性肝炎，在隨后分析GH-HS和GL-HS之間的特定細(xì)胞區(qū)室時重點(diǎn)研究了髓系細(xì)胞。

6.HSK31679 治療重塑了髓系細(xì)胞的動態(tài)變化，使其趨向于抗炎微環(huán)境

在所有髓系細(xì)胞亞群中，樹突狀細(xì)胞 (DC) 和巨噬細(xì)胞 (Mφ) 構(gòu)成了主要細(xì)胞類型（圖 5B）。通過無監(jiān)督聚類，首先關(guān)注 DCs 群體的內(nèi)在屬性和潛在功能，這些 DCs 群體被確定為減少的 CD8α+DCs（圖 6A、D）。值得注意的是，GH-HS 組中 Tregs 的 IL-12Rβ2 可以與 CD8α+DCs 衍生的 IL-35 相互作用（圖 6B、C）。如先前報道的那樣，可以增強(qiáng)炎癥過程的抑制功能。與GL-HS或GH-PL數(shù)據(jù)集相比，GH-HS的PBMCs中CD4+Foxp3+Tregs的數(shù)量增加（圖6D）。這些Tregs的抑制功能阻斷了IL-35的EBI3亞基的作用（圖6E），導(dǎo)致免疫原性顯著受損。這可能是由于STAT1/STAT3的異常激活和p38 MAPK/NF-κB信號通路的抑制（圖S8D和E）。此外，注意到DC簇的分布與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）的表達(dá)相關(guān)（圖6B），GGT是MASH進(jìn)展的公認(rèn)血清生物標(biāo)志物。在GH-HS的所有DC中（圖6A），GGT+樣本中CD1C+DCs（cDC2）的比例顯著增加，而與GL-HS或GH-PL組相比，DEC205+DCs（cDC1）的比例降低。盡管之前的研究報告了cDCs在促進(jìn)或抑制脂肪性肝炎中的不確定作用，但結(jié)果表明，cDC1和cDC2細(xì)胞對HSK31679治療的反應(yīng)方式相反。

對于巨噬細(xì)胞部分，通過無監(jiān)督聚類產(chǎn)生了6個具有不同基因特征的聚類。對兩個富含非經(jīng)典單核細(xì)胞簇的PBMCs進(jìn)行了表征：MINCLE+Mφ和S1PR2+Mφ。根據(jù)常規(guī)表型標(biāo)記物（TREM2+、MRC1+、CD163+、AGR1+）的高表達(dá)，其余簇均被鑒定為巨噬細(xì)胞（圖6A）。值得注意的是，巨噬細(xì)胞簇MINCLE+Mφ、S1PR2+Mφ和AGR1+Mφ顯示出相對不同的發(fā)展（圖6F、G）。在這些巨噬細(xì)胞簇中，AGR1+Mφ和MINCLE+Mφ是GH-HS和GL-HS組中改變的主要亞群，而S1PR2+Mφ在GH-HS組更具特征（圖5C）。然后研究了它們的不同功能狀態(tài)，并觀察到趨化因子（CCL3/15和CXCL10/12/14）在GH-HS中的表達(dá)降低，但在GL-HS樣本中沒有，這表明其是由這些Mφ簇募集T細(xì)胞的過程。GH-HS樣本的細(xì)胞相互作用分析也證實(shí)，抗炎巨噬細(xì)胞通過CCL3/15-CCR5、CXCL10/11-CXCR5和CXCL12/14-CXCR4信號傳導(dǎo)積極參與T細(xì)胞的募集（圖6C和S9B）。在GL-HS組中，MRC1+Mφ表達(dá)的CCL15/CXCL10水平升高，AGR1+Mφ高度表達(dá)CCL2/CXCL12（圖S9B）；而GH-HS組CCL22簇的優(yōu)勢Mφ從MINCLE+Mφ切換（圖6H和S9D），其AGR1+Mφ上調(diào)了RPS27、CDKN1C和KLRF1的表達(dá)水平（圖S10B），表明經(jīng)HSK31679處理的糞便來源GCS+參與者的巨噬細(xì)胞發(fā)生了重編程?？偨Y(jié)HSK31679治療的上述代謝指標(biāo)，GCS活性和糞便中B.thetaiotaomicron的相對豐度與肝臟ΔTG、ΔTC和ΔGGT水平等呈顯著負(fù)相關(guān)（圖6I）。這些結(jié)果表明，B.thetaiotaomitron介導(dǎo)的免疫抑制的GCS活性可能預(yù)測HSK31679治療個體的MASH緩解。

研究總結(jié)

該研究描繪了HSK31679通過抑制腸道微生物鞘脂的單糖基化來改善MASH的新圖譜。這項研究為腸道微生物和循環(huán)免疫因素提供了新的見解，這些因素可以作為MASH患者HSK31679治療的預(yù)后標(biāo)志物，以及基于腸道微生物群的MASLD治療的新靶點(diǎn)或策略。對于甲狀腺模擬物的進(jìn)一步4期上市后研究，應(yīng)系統(tǒng)地調(diào)查大規(guī)模隊列，研究抗菌組合對MASH個體長期結(jié)果的影響。

文章亮點(diǎn)

該研究證明了腸道微生物在 THR-β 激動劑治療 MASH 中的重要作用。發(fā)現(xiàn) HSK31679 通過抑制腸道 B. thetaiotaomicron?產(chǎn)生的鞘脂類物質(zhì)的單糖基化過程來減輕 MASH。揭示了腸道 GCS 活性可以作為 HSK31679 治療 MASH 的預(yù)測生物標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn) HSK31679 治療重塑了髓系細(xì)胞的動態(tài)變化，使其趨向于抗炎微環(huán)境。

參考文獻(xiàn)：

Zhang YH, Xie R, Dai CS, et al. Thyroid hormone receptor-beta agonist HSK31679 alleviates MASLD by modulating gut microbial sphingolipids. J Hepatol.?Published online August 22, 2024. doi:10.1016/j.jhep.2024.08.008